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本试剂盒适用于快速提取各种粪便DNA，采用DNA吸附柱和新型独特的溶液系统，能有效去除动物粪便中各种影响下游实验（如PCR）的抑制因子，并能高效地回收粪便中的基因组DNA。提取得到的DNA可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应。

常规的DNA纯化方式并不能有效地去除粪便中存在的大量抑制因子而导致下游实验的失败，如PCR不能扩增出所需片段。为此我公司推出了本试剂盒。

• 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
  
• 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
  
• 快速、简捷，单个样品操作一般可在40分钟内完成。
  
• 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9。

• 缓冲液ASL或者结合液CB低温时可能出现析出和沉淀，可以在70℃水浴几分钟帮助重新充分溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
  
• 蛋白酶K保存在即用型甘油缓冲液中，常温运输。收到后，不超过25℃室温至少保存6个月，4℃保存12个月，-20℃保存2年。
  
• 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

• 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
  
• 开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。
  
• 结合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
  
• 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在-20℃。DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。
  
• PCR可能被过量的DNA（一般大于1μg）抑制，使用最小用量的洗脱DNA（适当稀释）反而可以得到更好的扩增。一般加入的洗脱DNA体积不要超过总PCR反应体积的10％。我们建议在PCR反应体系中加入终浓度0.1μg/μl的BSA（牛血清白蛋白）有助于得到最佳扩增效果。

动物粪便样品经特殊缓冲液ASL重悬后，70℃处理5分钟裂解细菌；离心去除不溶解的杂质，蛋白酶K消化进一步去除蛋白和杂质；然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

• 第一次使用前请先在15mL漂洗液WB中加入60mL无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
  
• 平衡液预处理吸附柱备用：使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤，具体方法参见附录参考“关于平衡液的使用”。

• 收集约200～220mg粪便到一个2mL离心管，置冰上。
  
  • 如果是冰冻的标本，加入缓冲液ASL前不能解冻，否则DNA容易降解。
• 加1.4mL缓冲液ASL，连续涡旋振荡1分钟或者直到完全混匀均一。
  
  • 完全涡旋混匀，否则会严重降低产量。
• 将重悬物70℃温育5分钟。
  
  • 该加热步骤可以提高3-5倍DNA产量，并且帮助裂解细菌和寄生虫。对于某些难裂解的细胞（如革兰氏阳性菌）可以提高到95℃。
• 涡旋振荡15秒，室温放置1分钟。最高速离心1分钟沉淀粪便颗粒。
  
• 转移900μL上清到一个1.5mL离心管，加入100μL杂质清除剂AB，立刻涡旋振荡1分钟或者直到完全混匀均一，室温放置1分钟。最高速离心3分钟去除杂质。
  
• 转移所有上清到一个1.5mL离心管，最高速离心3分钟。
  
• 转移210μL上清到一个1.5mL离心管，加入20μL蛋白酶K溶液(20mg/mL)，充分混匀，加入200μL结合液CB，涡旋振荡15秒，充分混匀。70℃温育10分钟。
  
  • 如果产量偏低，可以转移更多的上清，并且相应的按比例提高蛋白酶K和结合液的和后面的异丙醇使用量。
• 冷却后加入100μL异丙醇，涡旋混匀。
  
• 将上一步所得溶液和可能出现的沉淀都加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。
  
• 加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm离心30秒，弃废液。
  
• 加入600μL漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30秒，弃掉废液。
  
• 加入600μL漂洗液WB，12000rpm离心30秒，弃掉废液。
  
• 将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
  
• 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100～150μL洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液可事先在65～70℃水浴中预热），室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟。
  
  • 洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50μL，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。
• DNA可以存放在2～8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。

• 洗脱液没有DNA或者产量低
  
  • 样品储存不当
    建议：样品应该储存在4℃或者-20℃。
    
  • 在缓冲液ASL中涡旋匀浆不充分
    建议：样品在ASL中充分的涡旋直到均一。
    
  • 和结合液CB混匀不充分
    建议：上清和结合液CB立即充分间断涡旋混匀。
    
  • 上离心柱前忘记加异丙醇
    建议：记住加异丙醇。
    
  • DNA洗脱不充分
    建议：洗脱前在室温放5分钟。
    
  • 第一次使用前，漂洗液WB中忘记加无水乙醇
    建议：在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇。
• A260/A280比值异常高
  
  • 残留RNA过高
    建议：洗脱缓冲液加RNase A，室温10～30分钟。
• DNA下游反应不正常
  
  • BSA没有加到PCR反应体系
    建议：PCR反应体系中加入终浓度0.1μg/μl的BSA。
    
  • 下游反应中使用的DNA过量了
    建议：假如DNA使用太多，可能会抑制PCR反应，因此可减少洗脱DNA使用量。
    
  • 非特异性扩增条带
    建议：洗脱液中目的DNA量太低，背景DNA过高，可以考虑使用热启动PCR聚合酶。
    
  • 某些目的细胞裂解困难，不充分导致产量低
    建议：可以把裂解液温育时间提高到95℃。
    
  • 没有足够DNA洗脱下来
    建议：查看上面可能的原因。
• 最初的离心步骤第4步骤后没有见到多少上清
  
  • 离心力不够
    建议：可以尝试14000rpm离心5分钟。
  
  
  
  关于平衡液的使用：
  
  • 介绍：核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成，请加热至37℃使沉淀完全消失。
    
  • 使用方法：取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取100μL的平衡液至柱子中。13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。
  
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